什么樣的進(jìn)階武器，會(huì)有那么大威力？

CUT&Tag——ChIP-Seq進(jìn)階武器
 
一、染色質(zhì)免疫沉淀后測(cè)序（ChIP-Seq）
ChIP-Seq是一種針對(duì)DNA結(jié)合蛋白、組蛋白修飾或者核小體的全基因組測(cè)序分析技術(shù)。其基本原理是利用甲醛處理細(xì)胞，使目標(biāo)蛋白與DNA交聯(lián)，通過(guò)超聲破碎將交聯(lián)后的染色質(zhì)打碎成小片段，一般在200-600bp。再利用抗原-抗體特異性識(shí)別反應(yīng)，將目的蛋白連同交聯(lián)的DNA片段一起沉淀下來(lái)。洗脫蛋白質(zhì)沉淀，對(duì)純化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，高通量測(cè)序，最后與已有的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，以確定與目的蛋白交聯(lián)的DNA的序列。
ChIP-Seq可以完整的反映與靶蛋白結(jié)合的DNA序列，是蛋白質(zhì)與DNA互作的經(jīng)典方法。但是常規(guī)的ChIP-Seq需要大量的細(xì)胞樣本，而且對(duì)培養(yǎng)環(huán)境、處理?xiàng)l件要求較高，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差、信噪比低。很多時(shí)候會(huì)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)了很長(zhǎng)周期的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)ChIP-Seq測(cè)序后得到的卻是大量的垃圾數(shù)據(jù)，這些限制了ChIP-Seq的應(yīng)用，亟需進(jìn)化升級(jí)。
二、CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagment）技術(shù)
2019年4月底，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士，在Nature Communication雜質(zhì)上公開了CUT&Tag技術(shù)的詳細(xì)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)方案。能在全基因?qū)用嫔蠙z測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用的DNA片段。這種方法相較于ChIP-Seq、pA-MNase等方法，更加簡(jiǎn)便，信噪比更高、重復(fù)性更好、需要的細(xì)胞數(shù)量更少，切有希望將蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合研究做到單細(xì)胞水平。
CUT&Tag方法是Active motif專利技術(shù)TAM-ChIP技術(shù)的一個(gè)變形。CUT&Tag是基于ChIP原理的一項(xiàng)技術(shù)，與ChIP的免疫沉淀步驟相比，同樣是利用抗原抗體結(jié)合，但是CUT&Tag是抗體孵育后直接剪切染色質(zhì)和制備文庫(kù)。
在CUT&Tag實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞首先要經(jīng)過(guò)透化處理，并將其與刀豆蛋白A一起孵育，以便于后續(xù)清洗步驟。細(xì)胞隨后先后與特異性抗體（一抗、二抗）孵育；然后將細(xì)胞與轉(zhuǎn)座體孵育，轉(zhuǎn)座體由帶有NGS接頭（adaptor）的Tn5轉(zhuǎn)座酶和蛋白A（protein A）融合而成。清洗掉未結(jié)合的轉(zhuǎn)座體。Tn5轉(zhuǎn)座酶是Mg²⁺依賴的酶，因此需要加入Mg²⁺以激活反應(yīng)，從而使染色質(zhì)被切割到接近蛋白結(jié)合位點(diǎn)的位置，同時(shí)鏈接上NGS測(cè)序接頭DNA序列。這使得染色質(zhì)裂解和文庫(kù)制備只需一步完成。
 
 
 
三、
CUT&Tag具體實(shí)驗(yàn)方案
1. 細(xì)胞預(yù)處理（0.5-1h）
1) 室溫下收集新鮮細(xì)胞置于EP管中并計(jì)數(shù)；低速離心，去溶液；
2) 管中加入細(xì)胞穿孔緩沖液重懸細(xì)胞；低速離心，去溶液；
3）管中加入細(xì)胞穿孔緩沖液再重懸細(xì)胞，輕柔震蕩并滴加Binding 緩沖液重懸的ConA磁珠，輕柔顛倒混勻5-10min；
2. 一抗結(jié)合目的蛋白（2h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來(lái)，將EP管靜置于磁力架上沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) EP管中加入預(yù)冷的抗體緩沖液將細(xì)胞重懸，輕柔震蕩后置于冰上;
3) 每管中加入0.5-1μl一抗（抗體使用生產(chǎn)商推薦濃度），輕柔震蕩；
4) 室溫下將EP管置于搖床上孵育2h；
3. 二抗結(jié)合一抗（1h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來(lái)，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) 將二抗1:100稀釋于穿孔緩沖液，加入管中，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育30-60min；
4) 快速離心細(xì)胞，將管蓋液體離心下來(lái)，EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml 穿孔緩沖液，上下顛倒10次；
6) 重復(fù)步驟4)、5) 兩次。
4. ChiTag轉(zhuǎn)座體結(jié)合抗體（1.5h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來(lái)，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) 將ChiTag轉(zhuǎn)座體1:250稀釋于穿孔緩沖液2中，并滴加于細(xì)胞上，輕柔震蕩；
3) 室溫下將EP管置于搖床上孵育1h；
4) 快速離心細(xì)胞，將管蓋液體離心下來(lái)，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
5) 管中加入0.8-1ml穿孔緩沖液2，上下顛倒10次；
6) 重復(fù)步驟4)、5) 兩次。
5. 激活ChiTag轉(zhuǎn)座體，片段化目的DNA（1h）
1) 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來(lái)，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
2) 管中加入300μl ChiTag激活緩沖液，輕柔震蕩；
3) 37ºC孵育1h。
6. DNA提取（1h）
7. PCR（1h），PCR之前需加入72ºC，5min步驟
8. DNA純化（30min）
9. 上機(jī)測(cè)序
具體時(shí)間、轉(zhuǎn)速需要根據(jù)不同的樣本、不同的研究目的進(jìn)行優(yōu)化。
 
 
 
四、CUT&Tag的局限性
1. CUT&Tag的自然狀態(tài)并不適合所有研究
未經(jīng)固定的細(xì)胞不適用CUT&Tag。在CUT&Tag最初的文章中，此技術(shù)只用于組蛋白修飾、NPAT、CTCF。許多轉(zhuǎn)錄因子并不大量表達(dá)，且與DNA結(jié)合是微弱的、瞬時(shí)的，甚至有時(shí)候是間接的與染色質(zhì)結(jié)合。對(duì)于這些情況，染色質(zhì)交聯(lián)和超聲處理是檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA相互作用的必要步驟。
大多數(shù)ChIP級(jí)別抗體，經(jīng)驗(yàn)證可用于交聯(lián)條件下，然而無(wú)法在自然情況下具有好的作用，因?yàn)榻宦?lián)條件下的蛋白質(zhì)表位可能不同于自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表位。因此從X-ChIP轉(zhuǎn)到CUT&Tag需要進(jìn)行抗體驗(yàn)證，以確定抗體在不固定的條件下的特異性和敏感性。
2. CUT&Tag可能引入偏差
用于CUT&Tag的Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)開放染色質(zhì)區(qū)域具有高度親和性。因此，CUT&Tag可能優(yōu)先適用于分析組蛋白修飾或與基因組活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)域相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，而不是非常適合于沉默或含有異染色質(zhì)的基因組區(qū)域。消化時(shí)間和pA-Tn5使用量需要每個(gè)目標(biāo)仔細(xì)優(yōu)化，以避免任何不特異的轉(zhuǎn)座反應(yīng)。
3. CUT&Tag技術(shù)還太新
雖然CUT&Tag已經(jīng)出現(xiàn)了有一段時(shí)間了，且很快就流行了起來(lái)。但是在2019年4月才首次發(fā)表詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。因此，在同行評(píng)議中并沒(méi)有很多包含CUT&Tag結(jié)果的數(shù)據(jù)出現(xiàn)。另外，CUT&Tag實(shí)驗(yàn)流程與ChIP-Seq相差很大，兩者的數(shù)據(jù)對(duì)比也比較困難，