Prime Editing，即引導(dǎo)編輯，是一項(xiàng)基于“搜索和替換”（search-and-replace）的基因組編輯方式。引導(dǎo)編輯由Broad研究所的David Liu實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)，于2019年最早發(fā)表在nature雜志上。Prime Editing的過(guò)程為：首先，將經(jīng)過(guò)改造的向?qū)?span style="font-family: Calibri;">RNA（pegRNA）與prime editor蛋白相結(jié)合，pegRNA具有雙重功能，既能夠?qū)⒕庉嫷鞍滓龑?dǎo)到目標(biāo)位點(diǎn)，又含有編輯的模板序列。prime editor蛋白則由Cas9切口酶和逆轉(zhuǎn)錄酶融合而成。在Cas9切割目標(biāo)位點(diǎn)之后，逆轉(zhuǎn)錄酶以pegRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后將DNA直接聚合到切口的DNA鏈上。

引導(dǎo)編輯一經(jīng)問(wèn)世就引起了廣泛關(guān)注，因?yàn)榻^大多數(shù)的致病遺傳變異都是堿基點(diǎn)突變及插入缺失突變，這也就意味著引導(dǎo)編輯在臨床基因治療中具有極大潛力。但目前引導(dǎo)編輯的編輯效率仍然較低，且暫時(shí)未能明確編輯效率的影響因素，此項(xiàng)技術(shù)尚處于起步階段，其應(yīng)用仍然受到極大限制。此前有針對(duì)pegRNAs的研究，發(fā)現(xiàn)pegRNAs的一種系統(tǒng)性改造能夠有效提高引導(dǎo)編輯的編輯效率，但引導(dǎo)編輯技術(shù)仍然存在很大的提升空間，大有可為。

日前，美國(guó)哈佛大學(xué)David Liu實(shí)驗(yàn)室與普林斯頓大學(xué)Britt Adamso實(shí)驗(yàn)室合作研究發(fā)表在了Cell雜志上，論文題目為Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes

作者利用利用匯集的CRISPRi篩選，發(fā)現(xiàn)DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR)阻礙了啟動(dòng)子編輯，并促進(jìn)了副產(chǎn)物產(chǎn)生，因此研究人員推斷，抑制DNA錯(cuò)配修復(fù)通路，很有可能會(huì)對(duì)prime editing的編輯效率和準(zhǔn)確性有提高作用。研究者還對(duì)prime editing系統(tǒng)融合蛋白進(jìn)行了優(yōu)化，并證實(shí)這種整體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可以進(jìn)一步提高prime editing的編輯效果。

在本研究中，作者把CRISPRi篩選和PE系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合，采用全新篩選策略Repair-seq，系統(tǒng)性分析了影響prime editing編輯效果的內(nèi)源性因子，最終篩選出抑制DNA錯(cuò)配修復(fù)通路的幾個(gè)關(guān)鍵因子，包括PMS2，MSH2，MSH6，MLH1。這幾種因子都可以有效提升prime editing的編輯效率。研究者發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)MLH1的ATP酶失活型突變體E34A或內(nèi)切核酸酶失活型突變體可以有效增強(qiáng)PE系統(tǒng)的基因編輯效率。研究者將PE2與MLH1 dn的組合稱(chēng)為PE4，將PE3與MLH1 dn的組合稱(chēng)為PE5。新的系統(tǒng)能夠瞬時(shí)表達(dá)抑制 DNA 錯(cuò)配修復(fù)的蛋白，以提高編輯效率。分析表明，與早期的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)相比，新系統(tǒng)的編輯效率要高出 2.0 到 7.7 倍。

研究人員還通過(guò)對(duì)系統(tǒng)中nCas9-MMLV融合蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高了prime editing的編輯效率。研究者將PEmax與改造后的pegRNAs（epegRNAs）以及MLH1 dn合用，發(fā)現(xiàn)這種組合方式可以最為顯著的提高prime editing的效率和準(zhǔn)確度。

本研究成功篩選出了對(duì)prime editing編輯效果產(chǎn)生影響的內(nèi)源性因子，并據(jù)此開(kāi)發(fā)出了提高prime editing編輯效率的新方向，取得了令人振奮的成績(jī)。本研究最終開(kāi)發(fā)出的PE升級(jí)版本PE4/PE4max以及PE5/PE5max為疾病的基因治療提供了更加強(qiáng)大的工具。